Varroa Transmisor de patógenos
esta investigación tuvo la finalidad de estudiar
ácaros Varroa destructor con síntomas
patógenos y de aislar los microorganismos provenientes de éste. Los ácaros
muertos se recogieron de los tableros pegajosos de las colmenas y se examinaron
bajo un estereomicroscopio. Los ácaros sospechosos de haber muerto a
consecuencia de un proceso patológico fueron examinados con métodos
bacteriológicos y micológicos. La patogenia de los microorganismos aislados se
comprobó a través de los ensayos que se describen en el trabajo. Durante la
investigación, se encontraron hembras con formaciones negras en la región
intestinal y también con una micosis de color blanco en el idiosoma y en su
superficie. Las bacterias Enterobacter cloacae, Staphylococcus albus
haemolyticus y los hongos Aspergillus flavus, Penicillium multicolor y P.
simplicissimum fueron aislados de individuos con manchas negras, y las
bacterias Enterobacter cloacae y los hongos Mucor ramosissimus, M. indicus y M.
hiemalis, de ácaros afectados por micosis. Las pruebas de laboratorio destinadas
a comprobar la patogenicidad de los microorganismos aislados se llevaron a cabo
en jaulas de laboratorio con 40 abejas y 15 hembras de Varroa destructor. Las
jaulas de laboratorio con abejas infestadas por Varroa destructor se
pulverizaron con un inóculo y solución salina estéril (en las jaulas control).
Los experimentos se efectuaron a 35° C de temperatura. Las pruebas de laboratorio
mostraron patogenia sólo para la bacteria Enterobacter cloacae, que causó una
mortalidad media de ácaros de 77,4 % en las jaulas de laboratorio. La
mortalidad en las jaulas control fue, en media, de 15,9 %. Al ensayarse sobre
otros microorganismos, no se comprobó una diferencia estadística frente a las
jaulas testigo. Los ácaros infectados por Enterobacter cloacae murieron y
evidenciaron modificaciones específicas de los tubos de Malpighi (observadas
macroscópicamente como modificación de estos órganos y del idiosoma), y la
membrana entre los escudos genital y esternal, o metapodal, habitualmente
estaba rota. Sin embargo, las manchas negras no se observaron en nuestras
pruebas de laboratorio.
Introducción Las investigaciones encaminadas a
identificar nuevas modalidades de combate biológico de Varroa destructor se
pueden centrar en: 1. Ensayar los microorganismos con patogenicidad demostrable
para otro género de ácaros. 2. Utilizar los ácaros predadores para atacar a
aquellos que viven en las provisiones de las colonias de abejas. 3. Encontrar
ácaros con síntomas infecciosos dentro de las colmenas. Centramos nuestros
estudios en la búsqueda de ácaros con síntomas patológicos e infecciosos, que
vivían en los desperdicios de la colmena y en torno a las larvas de abejas. Sin
embargo, nos limitamos a los patógenos bacterianos y fúngicos. Los
microorganismos patógenos, descritos en otros ácaros (Laelapidae, Iphiopsidae)
y garrapatas (Ixodia, Holothyridia), se pueden ensayar como agentes de combate
biológico de la varroosis, ya que estos organismos están emparentados con los
ácaros Varroidae. El estudio se centró en el huésped habitual del ácaro Varroa
jacobsoni - Apis cerana, pero las investigaciones de Anderson y Trueman (D.L.
ANDERSON et al., 2000) demostraron que Varroa jacobsoni es una especie distinta
de Varroa destructor, que infesta las colonias de abejas melíferas - Apis mellifera.
Lo que subraya la necesidad de buscar patógenos que afecten a determinadas
especies de Varroa. A los potenciales patógenos de los ácaros Varroa destructor
se les puede agrupar, de acuerdo con la taxonomía de los microorganismos, en:
nemátodos, protozoos, virus, rickettsia y hongos. Sólo nos vamos a referir a
los agentes patógenos con el potencial más importante de la literatura de
referencia. Los virus pueden ser agentes beneficiosos, ya que suelen invadir
los grupos stándard de celdas idénticas, infectándolas. Este factor resta
patogenicidad para el respectivo organismo, de manera que no se puede implicar
la patogenicidad de Varroa para las abejas melíferas. La principal desventaja
de los virus es su difícil cultivo masivo. En su mayoría, a los virus se les
cultiva in vivo. Polydnaviridae, Ascoviridae y Baculoviridae son patógenos
específicos de los artrópodos (D. CHANDLER et al., 2001). Los baculovirus
constituyen un grupo específico para el combate biológico (M.E. MARTIGNONI,
1984). Ellos infestan el intestino y penetran entre las células epiteliales del
organismo. Partículas semejantes a los virus se encontraron en el cuerpo
adiposo de los ácaros que infestaban las colonias de Apis mellifera, pero los
ensayos de transmisión de estas partículas fallaron. Los ácaros con diagnóstico
de partículas semejantes a los virus presentan modificaciones de color negro en
el tejido y el cuerpo adiposo del intestino (R.G. KLEESPIES, 2000). Un presunto
idiovirus fue aislado de los ácaros Varroa de colonias de abejas melíferas de
EE.UU., no obstante que su patogenicidad frente a los ácaros no haya sido
comprobada (S. CAMAZINE et al., 1998). Comisión Permanente de Patología Apícola
Las rickettsias fueron encontradas en los ácaros y las garrapatas, en grandes
concentraciones; pueden ser peligrosas para los humanos y otros vertebrados.
Otra desventaja es su difícil producción masiva, de manera que no se les debe
clasificar como potenciales agentes patológicos, como es el caso de los virus.
Otro organismo sin identificar, parecido a la rickettsia, fue encontrado en el
recto de los ácaros Varroa (T.P. LIU et al., 1988). Estos organismos fueron
descubiertos en todos los estadios de desarrollo. Las bacterias entran en la
categoría de los agentes patógenos de los insectos. Las familias
características de los entomopatógenos son: Bacillaceae, Enterbacteriaceae y
Streptococcaceae. El efecto patógeno de Bacillaceae suele ser provocado por la
síntesis de la toxina que se forma por la esporulación de los microbios.
Bacillus thuri ngiensis viene siendo utilizado en amplia escala en el combate
biológico. Así, por ejemplo, se le aplica para el combate de Galleria
mellonella L. en apicultura. B. thuringiensis mató adultos y larvas de ácaros
tetranycide (I. M. HALL et al., 1971), así como algunas especies de
Mesostigmata y Prostigmata (D. CHANDLER et al., 2001). Cepas de Bacillus
thuringiensis fueron aisladas del intestino de V. destructor, pero su
patogenicidad aún no se conoce (Z.F. GLIŃSKI et al., 1990). Sin embargo, las
bacterias no son patógenos específicos de los ácaros y su cultivo se lleva a
cabo, habitualmente, entre los 30 y 35°C, hecho característico para las
condiciones de cría del pollo. También la humedad de las colonias de abejas es
apropiada para el desarrollo de las bacterias. Los hongos se describen como uno
de los primeros agentes patógenos de los artrópodos en la historia. La
temperatura óptima se sitúa por arriba de los 25° C (S. BIRCHER et al., 1990).
Pueden resultar útiles para ser empleados en las colonias de abejas
precisamente durante el invierno. Sólo un escaso número de especies disponen de
una temperatura óptima de desarrollo superior a los 35° C, pero se presta
particular atención a su patogenicidad para los humanos, tal como es, por
ejemplo, el caso de Aspergillus. La mortalidad causada por las infecciones por
hongos se debe a la destrucción mecánica de los tejidos, la eliminación del
agua y la actividad de las micotoxinas (S. BIRCHER et al., 1990). Los hongos
Beauveria bassiana se utilizaron como micopesticidas en el combate de más de
700 especies de artrópodos (M.S. GOETTEL et al., 1992). Otro hongo patógeno
importante para los insectos es Metarhyzium anisopliae, y asimismo otras
especies del género Metarhyzium. Tienen una temperatura máxima de desarrollo de
38° C. La ventaja que presentan los hongos en el combate biológico es el fácil
cultivo de cantidades masivas. Sin embargo, B. bassiana y M. anisopliae pueden
ocasionar infecciones bajo condiciones de laboratorio, pero la infección de la
abeja aún no ha sido detectada (D. CHANDLER et al., 2001; J. WEISER, 1966).
Hirsutella thompsonii y Metarhizium anisopliae se evaluaron en el laboratorio y
en colmenas de observación, y los resultados fueron significativamente
positivos (KANGA et al., 2002. Parasitoides. La utilización de los ácaros
predadores depende de la humedad y la temperatura ambiente.
Ellos infestan a
los adultos, los distintos estadios de desarrollo y los huevos. La utilización
de los predadores entraña un gran riesgo potencial para los huevos de las abejas,
porque los consumen con predilección. Materiales y métodos Identificación de
los agentes patógenos Recolección de los ácaros Los ácaros Varroa fueron
recolectados, ya desde 1999, de los apiarios de Radnice (Chequia occidental).
Las colmenas (colonias de Apis mellifica L.) de los apiarios estaban provistas
de tableros de fondo cubiertos de una gasa de poros grandes (mallas de 10 mm) y
encima otra gasa separada (mallas de 3 mm). Las hembras muertas se quedaron
adheridas a los tableros de fondo, sin que las abejas las apartaran. Se
observaron de cerca los tableros y los ácaros muertos se estudiaron bajo
estereomicroscopio. Comisión Permanente de Patología Apícola Las modificaciones
patológicas se expresaron en los ácaros por un color oscuro bien visible,
caracterizándose incluso por el crecimiento de hongos sobre la superficie
corporal. Aislamiento Las hembras muertas de Varroa destructor, sospechosas de
haber muerto a consecuencia de un proceso patológico, se trataron con alcohol
etílico (70 %) y, ulteriormente, se partieron en dos. Una de las partes fue
colocada en 1 ml de solución salina y la otra en un tubo de ensayo, a 4° C de
temperatura, en vista de su ulterior examen. El fragmento de ácaro conservado
en solución salina se incubó durante 2 horas a 36° C de temperatura y
ulteriormente el fluido se inoculó sobre una placa de Petri y se incubó a 36° C
de temperatura. Para el cultivo bacteriano se utilizó agar Colombia al 5 % SB,
y para los hongos agar Sabouraud de dextrosa. Parte experimental Infecciones
experimentales El inóculo, con un contenido de 1x107 células en 1mm3 de
solución salina y 5 % de glucosa, se pulverizó sobre las abejas infestadas por
ácaros Varroa destructor en jaulas de laboratorio (Fig. 1). La parte superior
de las jaulas de laboratorio era de gasa (la luz de la malla 0,5 mm) y la parte
inferior era un fondo de cristal. Un número de 40 abejas y 15 ácaros fueron
colocados en cada jaula de laboratorio. Las abejas con ácaros de las jaulas de
laboratorio fueron pulverizadas con una solución salina libre de bacterias, al
5 % de glucosa. Figura 1 - Jaula de laboratorio (esbozo) Space for food =
espacio para el alimento; space for bees = espacio de abejas; glass bottom =
fondo de cristal Aislamiento Los ácaros muertos fueron retirados de la jaula de
laboratorio y desinfectados en superficie, igual que los ácaros caídos
espontáneamente. Luego, se efectuó la punción del idiosoma, y el fluido
obtenido fue cultivado y observado bajo microscopio. Resultados Ácaros con
manchas negras patológicas sobre los intestinos fueron encontrados entre los
desperdicios y la basura de la colmena.
El complejo de los divertículos intestinales
distal y lateral contenía una materia homogénea dura, de color negro. Esta
materia fue cultivada, siguiendo los métodos descritos. Comisión Permanente de
Patología Apícola - El ácaro Varroa destructor, con una materia
negra densa en los divertículos intestinales. (Preparación original,
estereomicroscopio, aumento: 20x). De estos ácaros se aislaron los siguientes
microorganismos: Hongos: Aspergillus flavus, Mucor ramosissimus, Mucor indicus,
Mucor hiemalis, Penicillium multicolor, Penicillium simplicissimum. Bacterias:
Enterobacter cloacae, Staphylococcus albus. La pulverización de las abejas con
un inóculo preparado con los microorganismos aislados mostró que Enterobacter
cloacae era el agente causante de infecciones en los ácaros. La mortalidad
registrada ascendió a 70-88,9 %. Los ácaros murieron en un intervalo de 48-72
horas, presentando un abultamiento específico del idiosoma. La membrana entre
los escudos genital ventral y esternal habitualmente estaba rota y soltaba un
fluido (figura 4). El fluido fue extraído del idiosoma intacto con una aguja de
jeringuilla estéril; se detectó la presencia de Enterobacter cloacae, tanto
microscópicamente como en cultivo bacteriano. Figura 3 - La materia de color
negro del tracto digestivo y las formaciones negras de los divertículos distal
y lateral del intestino. 1 - esófago, 2 - divertículos intestinales proximales,
3 - mesenterio anterior, 4 - divertículos intestinales laterales, 5 -
divertículos intestinales distales. (Preparación original, estereomicroscopio,
aumento: 20x). Figura 4 - Modificaciones patológicas en un tubo de Malpighi,
tras la infección artificial, con rotura de la membrana entre los escudos
dorsal y metapodal. 1 - abultamiento del tubo de Malpighi derecho, 2 - escudo
dorsal, 3 - escudo metapodal. (Preparación original, estereomicroscopio,
aumento: 20x). Comisión Permanente de Patología Apícola La mortaladad de los
ácaros de las jaulas de laboratorio control se situó entre 0 y 45 % (término
medio, 15,9 %). La mortalidad en las jaulas de laboratorio, ensayando otros
microorganismos aislados, no probó su patogenicidad. Aspergillus flavus -
mortalidad media 22,5 %; Mucor ramosissimus - en promedio, 25,2 %. Mucor
indicus - en promedio, 22,1 %; Mucor hiemalis - en promedio, 18,6 %;
Penicillium multicolor - en promedio, 12,5 %; Penicillium simplicissimum - en
promedio, 18,6 %; Staphylococcus albus - en promedio, 23,8 %. Todos los
resultados se sometieron al análisis estadístico empleando un cuadro de
contingencias, demostrando que p>0,95. Enterobacter cloacae se desarrolló en
las 12 horas siguientes a la inoculación sobre agar Colombia. Las colonias eran
radiales, de 2-4 mm de tamaño, con un centro engrosado. Son de color ceniza, de
consistencia mucosa. Las bacterias son gramnegativas, de forma de bastoncillo
corto, con el tamaño de 0,5-1 x 1-2 μm, según lo observado bajo el microscopio. Su identificación se comprobó
mediante ensayos bioquímicos.
Nuestros resultados fueron confirmados con la
Colección checa de microorganismos (Universidad Masaryk, Brno), donde se
efectuó la reidentificación de esta cepa. Enterobacter cloacae se desarrolló
muy bien sobre agar nutritivo (Nutrimento) (1 % extracto de vacuno, 1 %
peptona, 0,5 % NaCl, 2 % agar, pH 7,2), que se ha de utilizar para la
producción masiva. Discusiones Enterobacter cloacae fue descrito por Jordan, en
1891. D'Herelle describió esta bacteria como entomopatógena en la Península de
Yucatán, en 1910. La bacteria fue denominada Coccobacillus acridiorum. Esta
cepa causó epizootias de las langostas que emigraban en gran número de México a
Yucatán, y los investigadores observaron modificaciones de color negro y la
descomposición del epitelio de los órganos digestivos de las langostas, así
como su muerte a las 8 horas de la infección. La virulencia de la bacteria
aumentó, con las pasadas sucesivas (D'HERELLE, 1911, 1912). D'HERELLE aplicó la
bacteria por él aislada al combate biológico de las langostas en Argelia,
Argentina y Túnez, en los años 1910-1912 (D'HERELLE, 1911, 1912). En el período
1914-1916, SERGENT y L'HÉRITIER descubrieron la necesidad de la realización de
un número de pasadas sucesivas, de 12 (en D'Herelle) a 50, para que los
insectos murieran durante las 8 horas siguientes a la infección. Desde
entonces, una cepa tan virulenta como aquella de que dispuso D'Herelle no ha
vuelto a ser aislada (J. WEISER, 1966). Pudimos demostrar que Enterobacter
cloacae, encontrada en los órganos digestivos del ácaro Varroa destructor, es
patógena para éste. Hasta el presente, a esta bacteria no se le ha citado entre
los agentes de combate biológico con futuro de Varroa destructor, en el amplio
repaso de Chandler et al. (D. CHANDLER, 2001). Enterobacter cloacae es
taxonómicamente definido como gramnegativo, aerobio y no esporulante. Su
estructura antígena representa un mosaico específico. La temperatura óptima de
crecimiento se sitúa entre 30 y 37° C. La temperatura de 100° C lo mata en 2
minutos. La actividad bioquímica específica de esta especie aparece mencionada
en los trabajos de especialidad.
Anderson D.L. Trueman
